Caracterización molecular y patrón de susceptibilidad antimicrobiana de Escherichia coli productora de β-lactamasas de espectro extendido en infección del tracto urinario adquirida en la comunidad

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• 20 de julio de 2018
• Enfermedades Infecciosas
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RESUMEN

Introducción

Las infecciones del tracto urinario adquiridas en la comunidad (ITUac) causadas por cepas de Escherichia coliproductoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), principalmente por cepas que contienen el gen bla_CTX-M-15, es un fenómeno creciente a nivel mundial.

Objetivo

Determinar el patrón de susceptibilidad a antimicrobianos de cepas de E. coli productoras de BLEE causantes de ITUac y conocer su patrón molecular.

Materiales y Métodos

Se realizó un estudio descriptivo en Oaxaca, México, donde se incluyeron 288 cepas de E. coli aisladas de pacientes adultos con posible ITUac. Para obtener los patrones de susceptibilidad antimicrobiana se siguieron los criterios del CLSI y para obtener el análisis molecular se utilizó la técnica de RPC.

Resultados

Del total de cepas de E. coli aisladas, 31,3% fueron productoras de BLEE, presentando una menor susceptibilidad a antimicrobianos que las cepas no productoras de estas enzimas. El 95,6% de las cepas BLEE estudiadas fueron portadoras del gen bla_CTX-M.

Conclusiones

Un tercio de las ITUac causadas por E. coli en nuestra población fueron causadas por cepas BLEE, mostrando un alto nivel de resistencia a los antimicrobianos comúnmente utilizados en su tratamiento y disminuyendo las opciones terapéuticas para tratamientos empíricos en esta población.

INTRODUCCIÓN

Las infecciones del tracto urinario adquiridas en la comunidad (ITUac) son causa frecuente de visitas al médico, tanto en población adulta como en la pediátrica. En México, en el año 2016, se reportaron más de cuatro millones de estas infecciones y en el Estado de Oaxaca, más de 100.000¹, teniendo como principal agente etiológico, en ambos casos, a Escherichia coli.

Prescribir empíricamente antimicrobianos en las ITUac es una práctica común; sin embargo, la resistencia bacteriana a antimicrobianos ha incrementado globalmente, disminuyendo la tasa de efectividad del tratamiento empírico. Uno de los mecanismos de mayor impacto en el desarrollo de la multi-resistencia en bacterias como Ees la producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). Estas enzimas son capaces de conferir a las bacterias resistencia contra penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación y a monobactámicos (aztreonam); sin embargo, son sensibles a cefamicinas y carbapenémicos e inhibidas por moléculas como el ácido clavulánico. Desafortunadamente, las cepas productoras de estas enzimas son también resistentes a otros antimicrobianos, reduciendo considerablemente las opciones de tratamiento disponibles. A la fecha, se han identificado más de 200 tipos de BLEE, codificadas por diferentes genes conocidos como genes bla, siendo los más frecuentes TEM, SHV y CTX-M.

Antaño, los procesos infecciosos causados por las bacterias productoras de BLEE se acotaban a infecciones asociadas al cuidado de la salud, principalmente con bacterias portadoras de los genes TEM y SHV. Sin embargo, desde la descripción en Europa, a finales de los años noventa, de cepas productoras de BLEE causando infecciones en la comunidad (IC), el número de casos reportados a nivel mundial se ha incrementado y México no es la excepción^2,3. Este aumento en el número de casos de IC va de la mano con el aumento en el número de aislados tipo CTX-M, principalmente del subtipo CTX-M-15, la cepa más frecuentemente descrita en diversos centros epidemiológicos del mundo. Los primeros casos de cepas CTX-M en México fueron reportados en el año 2010⁴.

Los objetivos de este estudio fueron:

• Determinar la prevalencia de infecciones del tracto urinario en la comunidad causadas por cepas de Eproductoras de BLEE identificadas en un laboratorio privado de la ciudad de Oaxaca, México.
• Determinar la susceptibilidad antimicrobiana de estas cepas y
• Describir el perfil genético de los tipos de BLEE presentes en estas cepas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sujetos

Se incluyeron 1.422 pacientes adultos (995 mujeres y 427 hombres) con indicación de urocultivo por impresión diagnóstica de ITUac y no relacionada a la atención de la salud.

Aislamientos bacterianos

De julio a diciembre de 2016 se inocularon 1.422 muestras de orinas de los pacientes que acudieron a Laboratorios Galindo SC en la ciudad de Oaxaca, México. Las muestras de orina fueron recolectadas a partir del chorro medio de la micción, bajo técnica estéril, sembradas antes de cumplirse una hora desde su recolección, en agar sangre y agar McConkey, utilizando una asa calibrada estéril de 10 µL. Las placas fueron incubadas a 35 ± 2 °C por 16 a 18 h. Aquellas muestras que presentaron crecimiento bacteriano ≥ 100.000 ufc/mL fueron considerados como posibles casos de infección del tracto urinario (ITU) y fueron incluidas para estudio genético y de susceptibilidad antimicrobiana. La identificación de las bacterias gramnegativas causantes de estas infecciones fue realizada utilizando las galerías API^®/ID32 (bioMériux, Francia). Las cepas que fueron identificadas como E. coli fueron conservadas en caldo BHI conteniendo glicerol al 15% a – 70 °C hasta su análisis molecular.

Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos

La determinación de la susceptibilidad de las cepas de E. coli a 16 diferentes antimicrobianos, incluyendo cuatro cefalosporinas, se realizó mediante el método de Kirby Bauer, siguiendo las sugerencias del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)⁵. Brevemente, a partir de un cultivo fresco de la cepa, se realizó una suspensión la cual se ajustó a la escala 0,5 de Mc Farland y fue inoculada en agar Mueller Hinton para, posteriormente, ser incubada en condiciones aeróbicas a 35 ± 2 °C por 16 a 18 h. De acuerdo al tamaño del halo de inhibición, y a criterios definidos por el CLSI, las cepas fueron catalogadas como sensibles o resistentes (En esta última clasificación se incluyeron cepas definitivamente resistentes, así como con resistencia intermedia). Los antimicrobianos incluidos en el estudio fueron: amoxicilina/ácido clavulánico, cefepime, cefotaxima, cefoxitina, ceftazidima, ceftriaxona, ciprofloxacina, fosfomicina, gentamicina, imipenem, meropenem, nitrofurantoína, norfloxacina, piperacilina, tetraciclina y cotrimoxazol.

Identificación fenotípica de cepas productoras de BLEE

Se realizó antibiograma a todos los cultivos positivos para E. coli. Con el objetivo de realizar un tamizaje inicial para identificar la presencia de cepas productoras de BLEE, se realizó la prueba del doble disco, colocando en el centro del agar un disco conteniendo amoxicilina (20 µg) con ácido clavulánico (10 µg) y alrededor de éste, a 2,5 cm, discos de cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg), cefepime (30 µg) y ceftriaxona (30 µg). A aquellas cepas que tuvieron efecto sinérgico alrededor del disco central les fue realizada la prueba de combinación de discos, utilizando cefotaxima (30 µg) y ceftazidima (30 µg) y ambos antimicrobianos con ácido clavulánico (10 µg), de acuerdo a lo sugerido por el CLSI⁶. Un halo de inhibición ≥ 5 mm en alguno de los discos conteniendo ácido clavulánico comparado con el producido en los discos que no lo contienen, confirma la presencia de cepas productoras de BLEE.

Identificación genotípica de cepas productoras de BLEE

El ADN de las cepas productoras de BLEE se obtuvo mediante el método de ebullición, para lo cual se tomaron 1-2 colonias en estudio, las que fueron resuspendidas en 1 mL de agua libre de nucleasas. El ADN obtenido (2 µL) fue utilizado para determinar la presencia de los genes bla_CTX-M, bla_SHV y bla_TEM utilizando la técnica de reacción de polimerasa en cadena (RPC). La secuencia de los iniciadores específicos utilizados en este estudio y las condiciones de la reacción han sido descritas anteriormente⁷, siendo el tamaño de los productos de amplificación esperados para los genes bla_CTX-M, bla_SHV y bla_TEM, de 590, 214 y 847 pares de bases, respectivamente. Con el objetivo de confirmar la presencia de genes bla_CTX-M, 15 productos de RPC seleccionados al azar, con un peso molecular similar al esperado para este gen, fueron purificados usando las columnas Wizard PCR preps DNA purification system (Promega) y secuenciadas en forma bidireccional en el Laboratorio Central ADN de la ciudad de Morelia, México. Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron comparadas contra las descritas previamente en la literatura internacional (GenBank database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).