En el corazón de la edición génica

 

El sistema de edición CRISPR-Cas necesita sólo dos componentes para modificar el ADN: una guía correspondiente a una secuencia de ARN y una enzima nucleasa Cas, siendo Cas9 la más utilizada. El objetivo genómico específico se determina mediante el método de guía de ARN, que forma un complejo con Cas9, permitiendo que la enzima se una al sitio que contiene una complementaridad de bases. En este sitio es donde Cas9 corta el ADN, causando un quiebre de la doble hebra.

La formación de quiebres en la doble hebra puede activar uno de los dos principales mecanismos de reparación del ADN celular: vías en la célula: la recombinación no homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ) o el de reparación directa por homología (HDR). La vía de NHEJ repara una rotura añadiendo o eliminando nucleótidos al azar, lo que resulta en cambios en la secuencia de ADN, por lo que no es adecuado para fines de corrección génica. Por lo tanto, los enfoques se centran en la HDR, que utiliza secuencias homólogas (complementarias) para reparar las roturas de ADN, lo que hace posible introducir secuencias específicas para permitir reparación a medida.

Una entrega oportuna de los componentes CRISPR en un punto apropiado en el ciclo de división de la célula ya sea en la transición entre G1 y S, o en la transición entre G2 y la fases mitótica, puede conducir a un uso preferencial del camino HDR. Desafortunadamente, en trabajos anteriores la eficiencia de la reparación de HDR después de la acción de CRISPR-Cas9 ha sido indeseablemente baja tanto en cultivo de células madre de embriones humanos (eficiencia de aproximadamente del 2%) como en  embriones humanos (14,3 – 25% de eficiencia).

Hong Ma y colegas diseñaron constructos de  CRISPR-Cas9 para la edición de MYBPC3, y verificaron la unión al gen usando células madre humanas. Posteriormente empezaron a trabajarcon embriones humanos. Uno de los principales retos de usar CRISPR-Cas9 para editar estos genomas ha sido el fenómeno de mosaicismo, en el que las ineficiencias en la edición de genes resulta en embriones que contienen células modificadas y no modificadas. Esto puede llevar a una mezcla de células sanas y enfermas en varios tejidos y órganos, posiblemente causando síntomas patológicos.

os autores investigaron una situación en la que el padre tenía una copia mutante de MYBPC3 y la madre sólo tenía copias silvestres del gen. En los experimentos control, el 47,4% (9 de 19) de embriones fecundados in vitro no heredaron la copia mutante de MYBPC3, la proporción esperada dado que la mitad de los espermatozoides debería tener la copia silvestre del gen. Los autores demostraron que, si los componentes de la edición eran inyectados juntos con los espermatozoides en un óvulo humano (ovocito) en una etapa en el ciclo celular como metafase II (figura 1b), un 72,4% de los embriones resultantes (42 de 58) heredaban solamente la versión silvestre de MYBPC3. Los otros 16 embriones tenían copias de MYBPC3 con signos de edición mediada por NHEJ que se dirigía a la versión mutante del gen pero que no lo reparaba a la versión normal.  

Curiosamente, cuando los autores analizaron la corrección de MYBPC3 en los embriones, encontraron que sólo uno de los 42 embriones que tenían tipo MYBPC3 silvestre había utilizado el método CRISPR para su reparación. Sus resultados indican que la copia materna silvestre de MYBPC3 probablemente otorgó la plantilla de reparación, en lugar de la copia introducida. Esto contrasta con las observaciones en células madre, en las que se utilizó la plantilla de nucleótidos introducida por los investigadores para el proceso de reparación. Los autores proponen que el mecanismo de reparación del ADN que opera en un embrión temprano difiere de aquel que ocurre en células madre. En el embrión en el que se pudo detectar la corrección utilizando la plantilla de reparación, la secuencia de templado se encontró solo en un subconjunto de células, mientras que las restantes probablemente se habían corregido usando la versión materna de este gen.

Aunque los autores demostraron que se mantiene la integridad del genoma embrionario después de que la edición por CRISPR-Cas9, lo que es algo sumamente prometedor, se deben realizar más estudios y optimizaciones a esta tecnología. Estos tendrán que confirmar que el enfoque es seguro en términos de criterios como el mosaicismo, edición fuera de objetivo, y detección de anomalías en la edición de embriones, todo antes que pueda ser utilizado como terapia para enfermedades hereditarias. Sin embargo, este estudio pavimenta el camino para que las investigaciones con CRISPR-Cas9 lleguen a la clínica a futuro. Hasta entonces, las pruebas genéticas embrionarias durante la FIV siguen siendo el método estándar para prevenir la transmisión de enfermedades hereditarias.

 

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