Primer reporte de Escherichia coli diarreogénica en población pediátrica ambulatoria con diarrea atendida en la ciudad de La Plata, Argentina

Resumen

Escherichia coli diarreogénica comprende un grupo heterogéneo de cepas que presentan diversos factores de virulencia y causan diferentes síndromes diarreicos. Los patotipos más estudiados son Escherichia coli enteropatogénica (EPEC), Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) y Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC). El objetivo de este estudio fue estimar la frecuencia de infección de los diversos patotipos de E. coli diarreogénica en una población pediátrica ambulatoria con diarrea, atendida en el Hospital Sor María Ludovica de La Plata, Argentina, durante el período mayo-octubre de 2017. Los patotipos fueron detectados mediante la amplificación molecular de ocho genes de virulencia característicos. Se estudiaron las heces de 211 niños (76% menores de 5 años). Se detectó infección con E. coli diarreogénica en el 12,3% (n = 26/211) de los niños con diarrea. Los patotipos identificados fueron EAEC, ETEC (todos lt positivos), EPEC y STEC (stx2 y eae positivos). El patotipo EAEC fue prevalente en todos los grupos etarios, mientras que los patotipos ETEC, EPEC y STEC solamente se observaron en niños menores de 5 años. Este estudio constituye el primer reporte de detección por técnicas de amplificación molecular de Escherichia coli diarreogénica en una población pediátrica ambulatoria con diarrea, de la zona de La Plata. Se necesitan estudios más amplios que incluyan la caracterización de los aislamientos abarcando un mayor número de genes, controles asintomáticos, distintas épocas del año y población de diversas áreas geográficas para esclarecer la relevancia de la infección por E. coli diarreogénica en niños de Argentina.

Introducción

Escherichia coli diarreogénica (DEC) comprende un grupo heterogéneo de cepas de E. coli que causan diferentes síndromes diarreicos y presentan marcadas diferencias en los factores de virulencia, la patogenia y la epidemiología de la infección. A la fecha, se reconocen seis categorías, variantes patogénicas o patotipos: Escherichia coli enteropatogénica (EPEC), Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) y Escherichia coli de adherencia difusa (DAEC). La capacidad patogénica y el alcance epidemiológico de la última categoría, sin embargo, no se hallan completamente esclarecidos4, 11, 21.

Las frecuencias de infección humana con DEC presentaron amplias variaciones según la región geográfica, con valores que oscilaron entre el 1 y el 52%4, 6, 9, 10, 20, 23, 25, 26, 32. Estudios publicados en numerosos países de Latinoamérica señalaron una prevalencia regional diferencial de los diversos patotipos. Por ejemplo, la mayoría de los casos de diarrea reportados en México, Colombia y Nicaragua estaban asociados a ETEC. En la población de Brasil, Paraguay y Perú, el patotipo más frecuente fue EAEC, mientras que, en la República Argentina, Chile, Venezuela y Uruguay, el principal patotipo asociado a diarrea fue EPEC1, 2, 8, 16, 21, 28, 30.

En los reportes oficiales sobre agentes etiológicos de diarreas agudas de nuestro país, Shigella spp. y EPEC aparecen como los patógenos bacterianos identificados con mayor frecuencia13. Sin embargo, existe información muy limitada sobre la infección por los diversos patotipos diarreogénicas de E. coli (a excepción de STEC) en la población pediátrica con enfermedades diarreicas. El objetivo de este trabajo fue estimar la frecuencia de infección por los patotipos de Escherichia coli diarreogénica en la población pediátrica ambulatoria con diarrea atendida en el Hospital Sor María Ludovica de La Plata, Argentina, durante el período comprendido entre mayo y octubre de 2017.

Materiales y métodos

El estudio se realizó con una estrategia cuantitativa, con la aplicación de un diseño observacional, descriptivo, prospectivo y de corte transversal. El período estuvo comprendido entre mayo y octubre de 2017. El estudio incluyó las heces de niños menores de 15 años que presentaron un cuadro diarreico y que se atendieron en forma ambulatoria en el Hospital de Niños Sor María Ludovica de La Plata, Argentina. Se excluyeron del análisis las heces de niños hospitalizados, trasplantados, inmunosuprimidos, con enfermedades oncohematológicas o enfermedad intestinal inflamatoria crónica. La confidencialidad fue observada mediante la asignación de un código alfanumérico interno, que permitió mantener separada en todo momento la identidad de las muestras de heces (descartadas al término del estudio) de cualquier tipo de información personal. La investigación respetó las normas de buenas prácticas clínicas, la declaración de Helsinki, con todas sus enmiendas, y estuvo de conformidad con la normativa vigente aplicable.

Los patotipos de DEC fueron detectados mediante la amplificación molecular de ocho fragmentos de genes de virulencia característicos, con dos PCR múltiples (mPCR1 y mPCR2). Los genes investigados fueron los codificantes de la intimina (eae), la toxina termolábil LT (lt), las toxinas termoestables STP (stp) y STH (sth), el antígeno plasmídico de invasión H (ipaH), el activador transcripcional R (aggR) y las toxinas Shiga 1 (stx1) y Shiga 2 (stx2). Los patotipos fueron identificados según los genes de virulencia hallados en las colonias aisladas: EPEC (presencia de eae, ausencia de stx1 y stx2), ETEC (presencia de lt, stp y/o sth), EIEC (presencia de ipaH), STEC (presencia de stx1 y/o stx2, presencia o ausencia de eae) y EAEC (presencia de aggR). La detección molecular fue realizada aplicando una estrategia diagnóstica en dos etapas. La primera etapa consistió en la realización de las dos PCR múltiples con ADN proveniente del cultivo confluente. En caso de que se hubiera observado amplificación de algún gen, la segunda etapa consistió en la identificación de la colonia positiva (con genes de virulencia). Para tal efecto, el ADN de 10 a 20 colonias aisladas se utilizó como molde para las PCR individuales14. La colonia que presentó amplificación fue identificada por métodos fenotípicos (VITEK®2, Biomerieux) para confirmar la especie bacteriana3, 14.

La extracción de ADN y la amplificación molecular se llevaron a cabo según metodologías ya descritas3, 14. Brevemente, la materia fecal fue sembrada en agar MacConkey e incubada a 37 °C durante 24 h. Las colonias características que se desarrollaron se resuspendieron en buffer TE con Tritón X-100, se lisaron a 100 °C y se centrifugaron a 10.000 rpm. El ADN se conservó a –20 °C hasta su utilización. Las concentraciones en la mezcla de reacción fueron las siguientes: buffer 1 X y dNTP, 0,1 mM; Taq polimerasa, 0,03 U/μl y ADN, 1-5 μl. La concentración de MgCl2 fue 1,5 mM para mPCR1 y 0,75 mM en la mPCR214. Las concentraciones de primers fueron 0,2 pmol/μl (SK1, SK2, STh-f, STh-r, STp-f y STp-r); 0,25 pmol/μl (LT-R, LT-F, IpaH8 e IpaH15); 1 pmol/μl (aggRks1 y aggRkas2); 1,6 pmol/μl (stx1-F y stx1-R); 0,4 pmol/μl (stx2-F y stx2-R) y 0,125 pmol/μl (16S-f y 16S-r)14 (tabla S1, material suplementario).

El protocolo de ciclado de mPCR1 consistió en 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C 30 s, 56 °C 1 min y 72 °C 1 min. El protocolo de mPCR2 fue 94 °C 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C 30 s, 57 °C 1 min y 72 °C 30 s. La extensión final para ambos protocolos fue a 72 °C por 2 min3, 14. En cada amplificación, se utilizaron cepas control: E. coli 2348/69 (eae), E. coli KNH-172 (lt, stp), E. coli O126-53 (sth), E. coli C-481 (ipaH), E. coli 17-2 (aggR), E. coli EDL933 (stx1, stx2) y E. coli ATCC 2592214. Los productos de amplificación fueron detectados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2,5% y tinción con bromuro de etidio. Los perfiles de bandas fueron documentados con el sistema de adquisición de imágenes UVP Doc-It® LS, LifeScience Software.

Nora BeatrizMolinaaSebastiánOderizbCeciliaVescinabAlejandraCórdobaaJuan ÁngelBasualdoaMónica DelfinaSparoa

A Centro Universitario de Estudios Microbiológicos y Parasitológicos (CUDEMYP)-CIC, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina

b Sala de Microbiología, Hospital Interzonal de Niños Sor María Ludovica, La Plata, Argentina

Para descargar la investigación completa haga clik a continuación:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0325754121000407

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